口腔生物膜：开发、控制和分析

口腔中含有数百种微生物，这些微生物要么以浮游细胞的形式存在，要么被掺入生物膜中。大多数口腔微生物是共生生物。那些病原微生物可导致口腔感染，有时可引发全身性疾病。含有病原体的生物膜很难控制。许多常规抗菌剂已被证明是无效的。科学技术的最新进展为病原体控制和遏制提供了新的方法以及表征生物膜的方法。这一观点提供了（1）对生物膜发展的一般理解;（2）描述控制口腔生物膜的新兴化学和生物方法;（3）分析生物膜的高通量分析方法概述。

引言
尽管医疗设备的使用增强了医疗保健并改善了生活质量，但不幸的是，有无数的疾病和感染可归因于与医疗设备相关的生物膜。微生物可以在医疗器械表面定植并引起感染，有时甚至会导致医疗器械故障。感染是由多种病原体引起的。到目前为止，假单胞菌属、弧菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、李斯特菌属、链球菌属和分枝杆菌已被确定为引起生物膜诱导的感染。

生物膜

微生物通过生物膜的形成进化出一种独特的生存策略。许多微生物从浮游生物状态进化而来，并结合在一起形成复杂的基质状结构，称为生物膜。生物膜是致密的微群落，生长在惰性表面上，并用分泌的聚合物包裹自己。当生物体形成生物膜时，它们能够通过改变其基因表达模式来适应环境变化。生物膜结构和基因表达的相应变化可以保护微生物免受消毒剂或抗生素的侵害。由此产生的生物膜会造成严重的公共卫生问题。

生物膜开发
生物膜的形成是一个动态过程。当浮游微生物附着在表面时，生物体可以与其他微生物结合形成复杂的生物膜。每个生物都有自己独特的粘附表面的方法。其中一些模式包括通过鞭毛、菌毛、蛋白质和多糖粘附素的附着。微生物可以在生物和非生物表面聚集并形成生物膜，因此难以识别和分离治疗靶点。细菌细胞的初始附着是生物膜形成的关键阶段。一旦附着开始，根据环境条件，细菌有两种选择。它们可以通过粘附在表面而形成生物膜，或者它们可以恢复到浮游阶段。对于那些进入生物膜的生物体，发育随着分散阶段的开始而停止，在这个阶段，毒力细胞从生物膜上脱落并经常引起宿主感染。图1总结了生物膜生命周期的不同阶段。

生物膜生命周期。（a） 第1阶段：浮游细菌和自由漂浮的细菌随机或通过化学吸引与表面接触;（b） 第二阶段：细胞在表面聚集并形成微菌落;形成新生的生物膜;（c） 第三阶段：扩散阶段，毒菌分散，容易定植于其他表面。

生物膜的成分
生物膜由许多生物组成，形成一个多细胞实体。生物膜复合物由排泄的聚合物化合物（EPS）基质结合在一起。该基质在生物膜内提供保护、粘附、稳定和营养。大部分生物膜基质（91%）由水组成。水既可以作为溶剂，也可以直接与微生物细胞结合。水是一个不可或缺的组成部分，因为它有助于生物膜的扩散。生物膜的微生物含量约为 5%，EPS 基质占另外 2%，DNA、RNA 和蛋白质占另外 2%。基质的结构因细菌组成和环境条件而异。

口腔生物膜
口腔内有多种生物膜。事实上，口腔在微生物多样性水平上是独一无二的，支持多达1000种不同种类的微生物。天然牙列和假牙，包括假牙和植入物，是生物膜的基质。

牙菌斑 虽然口腔暴露在空气中，但一旦被细菌定植，牙齿表面可能会变得厌氧 [ 7]。牙菌斑是口腔中的一种多微生物生物膜，可引起人类感染，如龋齿和牙周病。斑块含有多种微生物，嵌入聚合物的细胞外基质中。牙菌斑也可能在牙齿和牙龈缝隙之间形成，使其更难去除。感染部位不容易通过治疗进行治疗;抗生素不能穿透并到达感染部位。牙龈下缝隙内发育斑块的主要营养来源是牙龈缝液 （GCF）。GCF 提供蛋白质、营养素和糖蛋白。一旦口腔生物膜形成，就会产生蛋白水解酶，这些酶会对软组织和硬组织造成直接损害。或者，它们可以干扰宿主防御机制。

假牙 假牙佩戴者经常携带生物膜，其中包括白色念珠菌，这是一种定植于假牙材料聚丙烯酸甲酯 （PMA） 的致病真菌。口腔念珠菌的流行使假牙佩戴者面临假牙口炎的风险，这是一种口腔组织的炎症。超过65%的假牙佩戴者患有口腔炎，这种疾病会导致口腔健康不佳、牙齿卫生不良和包括糖尿病在内的全身性疾病。

种植体 种植牙是由钛和塑料材料制成的合成结构，可替代缺失的牙齿。植入物的人可能会在植入物区域出现感染和炎症。与植入物相关的细菌可能会聚集并形成生物膜。植入物的表面特性（包括粗糙度）可能会影响细菌对植入物的粘附，并有助于生物膜的生长。这些表面上病原生物膜的形成可能导致炎症。种植体周围炎是一种破坏性的炎症过程，会影响口腔中支持种植体的组织。

生物膜 医学挑战 如前所述，生物膜的物理性质及其所具有的生存机制，无论是表型适应性还是遗传抗性，都使它们不受抗生素治疗的影响。鉴于对传统抗菌疗法缺乏反应，生物膜感染目前对医学和牙科学界构成巨大挑战，并导致许多慢性感染。与宿主天然组织生物膜形成相关的一些疾病/感染包括囊性纤维化、自体瓣膜心内膜炎、中耳炎和牙周炎。

虽然不同类型的医疗设备都含有生物膜，但假牙是最普遍的。根据美国口腔修复学会 （ACP） 的数据，有 3600 万美国人没有牙齿，超过 1.12 亿人至少缺了一颗牙齿。此外，百分之九十的无牙颌患者都有假牙。预计未来15年无牙颌患者人数将增至2亿，假牙生物膜引起的感染患病率也必将增加。

生物膜的存在，特别是在老年人群中，他们是最脆弱的群体之一，缺乏机械清洁假牙的手动灵活性，不仅会导致口腔感染，如假牙口炎，还会导致致命的全身感染，如吸入性肺炎和慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）。

 

控制口腔生物膜的化学和生物方法

 

尽管根除生物膜很困难，但确实存在几种控制它们的常规策略。去除生物膜的方法包括机械或物理方法，例如刷牙。在本文中，我们主要关注现有的化学和生物学方法。通过刷牙物理去除假牙上的生物膜对于帮助预防感染是常见且重要的。然而，研究表明，仅靠刷牙是不够的，应该在日常护理中添加某种形式的清洁剂。

当前策略
清洁假牙的一种流行方法使用碱性过氧化物，其形式为片剂。当加入水中时，片剂产生泡腾碱性溶液，产生过氧化氢和活性氧;能够渗透和清洁仅刷牙无法到达的区域的化学物质。发表在《临床口腔研究杂志》上的一项研究研究了每天用牙齿清洁剂浸泡假牙的影响。在这项研究中，在实验室中培养的具有多物种生物膜的丙烯酸树脂假牙每天浸泡在市售的含碱性过氧化物酶的假牙清洁剂中，长达三分钟。这进行了七天，并与对照假牙组进行了比较。使用菌落形成单位和细胞外多糖形成作为量化结果的参数，研究人员能够证明每天浸泡减少了假牙上的生物总数，包括仅在一天后完全根除有核镰刀菌和裂核弧菌。

在比较机械（即用洁牙剂刷牙）和化学（即泡腾碱性）假牙卫生方法的效果时，Paranhos等人发现，某些微生物生物膜同样容易受到化学和机械方法的影响，而其他微生物则不然[16]。金黄色葡萄球菌、变形链球菌和铜绿假单胞菌是具有相同易感性的方法或组合的生物;然而，粪肠杆菌、白色念珠菌和光滑梭菌在使用机械方法或两种方法的组合时，细胞数量减少幅度更大。

抗牙菌斑漱口水已被证明对生物膜有效[17]。虽然能有效去除牙菌斑，但含有葡萄糖酸氯己定的漱口水以及含有精油的漱口水会产生不必要的副作用。牙齿变色和偶尔的味觉丧失是与使用葡萄糖酸氯己定相关的一些副作用。精油没有这些不必要的副作用，并且对哺乳动物的毒性很低，因此是首选。其中一些漱口水配方中添加了各种酶，以帮助降解生物膜的蛋白质基质。

天然的草药漱口水也可用于对抗口腔感染。其中一种产品是一种市售的草本、无酒精、成膜的漱口水，含有积雪草、紫锥菊和接骨木[ 18]。鉴于其成分的天然抗炎和抗菌特性，这种漱口水已被证明可有效防止牙菌斑堆积[ 18]。在被要求在两周内避免任何其他形式的口腔卫生的研究参与者中，植物漱口水在预防牙菌斑形成和牙龈炎症方面显示出明显的优势。

研究策略
在控制生物膜的研究策略中，有些具有杀菌潜力，有些具有辅助治疗潜力。

杀菌噬菌体或细菌病毒可用于有针对性和有效的方式根除细菌生物膜。噬菌体通过杀死细菌细胞来破坏基质内的生物膜。一项关于T4噬菌体对大肠杆菌生物膜影响的研究报道了有效的生物膜破坏。噬菌体易于复制，相对便宜，并且迄今为止尚未与不良事件相关联。然而，它们仍然存在吸附细菌靶受体和绕过生物膜EPS基质的问题。添加酶，如多糖解聚酶，可以穿透基质。使用噬菌体进行生物膜处理仍处于研究阶段。

抗菌肽（AMP）是根除生物膜形成细菌的另一种策略。AMP可以是天然的，也可以是合成的。天然AMP是生物体免疫系统的一部分。在人类中，这些可以预防感染的氨基酸短链主要在上皮表面表达。AMP的作用机制各不相同，包括通过产生亲水通道、破坏脂质双层的稳定性，甚至改变膜的曲率来破坏细菌细胞膜。这些机制导致细菌细胞渗透和死亡。口腔中的一些天然AMP也通过抑制骨脱矿细胞，破骨细胞的形成而表现出宿主愈合特性。

为了专门优化天然AMP的抗生物膜特性，已经开发了合成AMPs。虽然大多数关于AMP的研究都是在变形链球菌上进行的，但KSL是一种具有广泛抗菌活性的α螺旋合成AMP，已被证明对13种不同的细菌菌株有效。它通过静电相互作用破坏细菌膜的稳定性来起作用。除广谱肽外，通过不同肽的融合，实现了窄谱合成肽的开发。

特异性靶向AMP（STAMPs）对特定致病菌具有抗菌活性[20]。Eckert等人进行的一项研究评估了几种变形链球菌特异性STAMP的抗生物膜活性[20]。他们能够通过将一种称为能力刺激肽（CSP）的天然细菌信息素掺入肽中作为靶向结构域来靶向变形链球菌。开发的STAMP对浮游生物和生物膜变形链球菌细胞均有活性，对葡萄球菌属的其他成员（包括Gorodonii和血葡萄球菌）没有活性。无臭、无味、无色、无染色效应将使AMP和STAMP成为预防口腔和牙齿感染的绝佳选择。

辅助治疗 群体感应（QS）是微生物用来以细胞密度依赖性方式发送信号的一种化学细胞间通信形式。群体感应系统最早在费氏弧菌中发现，在许多其他细菌属中被发现，包括假单胞菌属、大肠杆菌属和链球菌属，甚至真菌，如白色念珠菌[21,22]。微生物使用群体感应系统来控制与表型相关的基因表达。在细菌生物膜的背景下，群体感应涉及其生命周期的关键组成部分，包括细胞扩散和对根除方法的抗性[ 21]。在白色念珠菌中，QS促进形态的转变，使生物膜形成并最终实现细胞分散。

靶向QS系统并抑制细菌细胞之间的交流为对抗细菌生物膜提供了一种新方法。目前正在进行研究，以在QS系统中寻找最佳目标。需要注意的是，虽然QS抑制剂可能会阻碍生物膜的成熟，但它们不能杀死浮游细菌细胞。因此，群体感应抑制剂（Quorum Sensing Inhibitors， QSI）可以与抗生素联合使用，以帮助控制生物膜感染。

分析方法

随着研究生物膜生长的重要性在医学研究中变得越来越普遍，开发新的高通量分析和表征技术的需求至关重要。通过研究生物膜生长模式，相信将阐明优越的治疗耐药机制。

微孔板检测
以高通量形式生长和定量生物膜的最常见和最有效的方法之一是使用 96 孔微量滴定板。该方法具有可重复性、高效性和成本效益的特点。数据采集所需的材料，如微量滴定板和酶标仪，是大多数微生物实验室的标准设备。

卡尔加里设备
卡尔加里设备是 96 孔格式的变体。卡尔加里装置是一种允许生物膜和浮游细胞分批培养生长并测量细胞的最低抑制浓度 （MIC）、最低细菌浓度 （MBC） 和最低生物膜根除浓度 （MBEC） 的方法。它基于使用改良的 96 孔微量滴定板，该板带有连接到可拆卸盖子上的钉子。钉子设计为可从盖子上取下。这允许对生物膜结构进行显微观察。卡尔加里反应容器的底部腔室中有通道，允许介质流过钉子，从而在每个钉子上形成等效的生物膜。

生物通量装置
卡尔加里装置方法仅对静态生物膜足够。还需要开发动态生物膜的高通量方法，因为这些方法与天然生物膜比静态生物膜更相似。BioFlux 设备是一种能够筛选流动生物膜活力的新设备。它使用高通量系统，通过酶标仪快速测量流动生物膜的荧光。BioFlux 系统使用微流体来模拟活细胞的体内生长条件。每个专门设计的板包含 96 个孔。有一个输入井和一个输出井，它们之间有一个小通道，用作细胞或细菌的生长平台，并允许培养基从输入井流向输出井。倒置显微镜可用于通过明场、相位、荧光和共聚焦显微镜来可视化和量化每个通道中的生长。井之间的绝对流量由气动泵系统控制，气动泵密封井的顶部并加压以调节流量。

共聚焦激光扫描显微镜
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是分析生物膜活力和结构的非常有用的工具。使用CLSM的最大优势之一是它减少了在分析前处理生物膜的需要，最大限度地减少了对生物膜的破坏。CLSM也变得非常受欢迎，因为它能够提供完整的全水合生物膜材料的光学薄切片，这使其成为研究生物膜结构和取向的理想选择。除了常规成像外，CLSM还能够堆叠光学切片图像，以形成生物膜材料的三维重建，从而实现生物膜的深度和宽度的可视化。使用CLSM，可以使用不同的染色方法确定生物膜细胞活力。细胞渗透性荧光染料 SYTO 59 用于将所有细胞染成红色，而细胞不可渗透性荧光染料 SYTOX 仅标记含有细胞壁的细胞绿色。将这两种染料一起使用，并在CLSM下使用不同的波长对它们进行成像，可以可视化生物膜中的活细胞和死细胞。

原子力显微镜
另一种用于研究生物膜形貌的方法是原子力显微镜（AFM）。AFM使用连接到悬臂的极其锋利的尖端（探针）。激光从悬臂平面的顶部反射到光学透镜上，该透镜测量悬臂的运动并记录样品的形貌图像。使用AFM测量表面有两种不同的方法：接触式AFM和非接触式AFM。在接触式原子力显微镜中，探针沿着样品表面拖动，悬臂的弯曲由激光测量。在非接触式原子力显微镜中，探针在样品表面上方振荡，当针尖接近表面时，探针和样品之间的分子吸引力导致振荡减小。AFM已被用于表征生物膜在各种基材上的粘附和结合强度。

结论

在过去的十年中，生物膜知识方面取得了重大进展。生物膜的发展及其结构一直是许多研究的主题。微生物生态学与口腔和全身性疾病之间的关系已经确立。采用科学和技术进步的持续努力将导致新的诊断分析、预防性治疗和治疗干预。